AG Carrier

Genetik, Pathophysiologie und Therapie der hypertrophen Kardiomyopathie

Arbeitsgruppenleiterin

Prof. Dr. Lucie Carrier 57208 [email protected]

Wissenschaftliche Mitarbeiter

Dr. Giulia Mearini 53180 [email protected]

Dr. Saskia Schlossarek 54707 [email protected]

Dr. Frederik Flenner 58597 [email protected]

Technische Assistentinnen

Elisabeth Krämer 58597 [email protected]

Silke Reischmann-Düsener 52179 [email protected]

Naturwissenschaftliche Doktoranden

Sonia Singh 58597 [email protected]

Antonia Zech 59770 [email protected]

AG Hirt

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From left to right: Ann-Cathrin Kunze, Tessa Werner, Dr. Marc Hirt, Dr. Marita Rodriguez, Dr. Benjamin Kloth, Jutta Starbatty, Dr. Sandra Funcke

Addtional team members: Lena Bartholdt (also Pharmacoepigenetics), Jan-Tobias Hensel (also Pharmacoepigenetics), Aljosha Muttardi

Former members: Dr. Nils Sörensen, Dr. Jasper Boeddinghaus, Paul Demin

Mehr über unser Team...

Most fascinating is that engineered heart tissues (EHTs) beat spontaneously. In contrast to simple cell cultures of cardiomyocytes EHTs provide the opportunity to assess the essential cardiac properties frequency and force which can be analyzed automatically with technologies developed by the groups of Eschenhagen/Hansen in our institute.

The idea behind our cardiac hypertrophy model is the enhancement of afterload/workload (AE = afterload enhancement) of these small tissue strips by a simple mechanical metal brace.

And it works! The model of cardiac hypertrophy displays in vitro many aspects of cardiac hypertrophy/heart failure: Cardiomyocyte hypertrophy, fibrosis, metabolic changes towards glycolysis, characteristic changes in coding and noncoding RNAs and many more.

Literature:

Please find all technical details, our findings with the model, some other research we performed and cooperations in the publications below:

1. General practitioners' adherence to chronic heart failure guidelines regarding medication: the GP-HF study. Hirt MN, Muttardi A, Helms TM, van den Bussche H, Eschenhagen T. Clin Res Cardiol. 2015 Nov 9. [Epub ahead of print]; PMID:26552905

2. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Hirt MN, Werner T, Indenbirken D, Alawi M, Demin P, Kunze AC, Stenzig J, Starbatty J, Hansen A, Fiedler J, Thum T, Eschenhagen T. J Mol Cell Cardiol. 2015 Apr;81:1-9. doi: 10.1016/j.yjmcc.2015.01.008. [Epub ahead of print]; PMID: 25633833

3. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. Hirt MN, Boeddinghaus J, Mitchell A, Schaaf S, Börnchen C, Müller C, Schulz H, Hubner N, Stenzig J, Stoehr A, Neuber C, Eder A, Luther PK, Hansen A, Eschenhagen T. J Mol Cell Cardiol. 2014 Sep;74:151-61. doi: 10.1016/j.yjmcc.2014.05.009. Epub 2014 May 19.; PMID: 24852842

4. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. Stoehr A, Neuber C, Baldauf C, Vollert I, Friedrich FW, Flenner F, Carrier L, Eder A, Schaaf S, Hirt MN, Aksehirlioglu B, Tong CW, Moretti A, Eschenhagen T, Hansen A. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2014 May;306(9):H1353-63. doi: 10.1152/ajpheart.00705.2013. Epub 2014 Feb 28.; PMID: 24585781

5. Cardiac tissue engineering: state of the art. Hirt MN, Hansen A, Eschenhagen T. Circ Res. 2014 Jan 17;114(2):354-67. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.300522. Review. PMID: 24436431

6. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. Stöhr A, Friedrich FW, Flenner F, Geertz B, Eder A, Schaaf S, Hirt MN, Uebeler J, Schlossarek S, Carrier L, Hansen A, Eschenhagen T. J Mol Cell Cardiol. 2013 Oct;63:189-98. doi: 10.1016/j.yjmcc.2013.07.011. Epub 2013 Jul 26.; PMID: 23896226

7. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Hirt MN, Sörensen NA, Bartholdt LM, Boeddinghaus J, Schaaf S, Eder A, Vollert I, Stöhr A, Schulze T, Witten A, Stoll M, Hansen A, Eschenhagen T. Basic Res Cardiol. 2012 Nov;107(6):307. doi: 10.1007/s00395-012-0307-z. Epub 2012 Oct 26.; PMID: 23099820

8. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. Schaaf S, Shibamiya A, Mewe M, Eder A, Stöhr A, Hirt MN, Rau T, Zimmermann WH, Conradi L, Eschenhagen T, Hansen A. PLoS One. 2011;6(10):e26397. doi: 10.1371/journal.pone.0026397. Epub 2011 Oct 20.; PMID: 22028871

9. Vernakalant: a novel antiarrhythmic drug for the rapid conversion of atrial fibrillation to sinus rhythm. Hirt MN, Eschenhagen T. Dtsch Med Wochenschr. 2010 May;135(19):971-6. doi: 10.1055/s-0030-1253686. Epub 2010 May 5. Review. German.; PMID: 20446233

10. Kidney injury molecule 1 (Kim1) is a novel ciliary molecule and interactor of polycystin 2. Kuehn EW, Hirt MN, John AK, Muehlenhardt P, Boehlke C, Pütz M, Kramer-Zucker AG, Bashkurov M, van de Weyer PS, Kotsis F, Walz G. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Dec 28;364(4):861-6. doi: 10.1016/j.bbrc.2007.10.103. Epub 2007 Oct 26.; PMID: 18273441

Gegenstand der Arbeiten sind elektrophsysiologische Mechanismen, welche die elektrische Refraktärität bestimmen und Kontraktionskraft des Herzmuskels regulieren. Die Aktivitäten konzentrieren sich auf die Messung von Ionenströmen in isolierten Zellen als auch auf die Messung von Aktionspotentialen und Kraft in intakten Muskelpräparaten. Ein Schwerpunkt ist das chronische Vorhofflimmern des Menschen (AF). Wir befassen uns mit der Frage in welcher Form AF die elektrophsysiologischen Eigenschaften des menschlichen Vorhofs beeinflusst. Zum einen geht um die Gründe für die gestörte elektromechanische Kopplung im AF, zum anderen darum neue potentielle Targets für eine Anti-AF Therapie zu identifizieren. Zu diesem Zweck bestimmen wir den Effekt einer Blockade verschiedener Ionenkanälen. Ein anderes Arbeitsgebiet ist die Charakterisierung der Effekte einer Stimulation adrenerger Rezeptoren auf den Herzmuskel. Ein zweiter Schwerpunkt liegt in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (hIPSC-CM). Die Verfügbarkeit von hIPSC-CM eröffnet große Möglichkeiten. sowohl als therapeutische . HIPSC-CM könnten therapeutisch aber auch als pharmakologisches Modell benutzt werden. Da hPISC-CM menschlichen Ursprungs sind, sollten sie die typischen elektrophsysiologischen Eigenschaften menschlicher Hertzmuskelzellen zeigen. Offensichtlich exprimieren hIPSC-CM die wesentlichen kardialen Ionenströme, allerdings sind ist die exakte Regulation von Refraktärität und Kontraktilität nur wenig bekannt. Daher versuchen wir die elektrophsysiologischen Eigenschaften von hIPSC-CM mit denen reifer, menschlicher Herzmuskelzellen zu vergleichen.

Das Team der kardialen Elektrophysiologie finden Sie hier...

Wissenschaftliche Interessen:

Die Arbeitsgruppe untersucht die molekularen Grundlagen, die zur Veränderung der Signaltransduktion bei kardiovaskulären Erkrankungen beitragen. Der Fokus der Forschungsprojekte liegt in der Untersuchung krankheitsspezifischer post-translationaler Modifikationsmuster wie Dephosphorylierung, oxidative Modifikationen wie S-Glutathionylierung, Inter-und Intradisulfidbrückenbildung in Redox-Sensorproteinen und deren Auswirkungen auf die Myofilamentfunktion und die Aktivität von Proteinkinase-Signalwegen. Die Projekte beinhalten die Anwendung einer Vielzahl unterschiedlicher biochemischer, molekularbiologischer und physiologischer Techniken. Dazu gehört die Isolation, Kultur von adulten und neonatalen Kardiomyozyten, DNA-Manipulation, Histologie, Immunofluoreszenz, Konfokale Mikroskopie, Kinase-Aktivitätsassays mit Hilfe von FRET, second-messenger Bindungsassays, Redox-Proteomics.

Ausgewählte Publikationen

2015

• Flenner F, Friedrich FW, Ungeheuer N, Christ T, Geertz B, Reischmann S, Wagner S, Stathopoulou K, Sohren KD, Weinberger F, Schwedhelm E, Cuello F, Maier LS, Eschenhagen T, Carrier L. Ranolazine antagonizes catecholamine-induced dysfunction in isolated cardiomyocytes, but lacks long-term therapeutic effects in vivo in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy. Cardiovasc Res. 2015
• Carrier L, Mearini G, Stathopoulou K, Cuello F. Cardiac myosin-binding protein c (MYBPC3) in cardiac pathophysiology. Gene. 2015;573:188-197 2014 Lorenz K, Stathopoulou K, Schmid E, Eder P, Cuello F. Heart failure-specific changes in protein kinase signalling. Pflugers Arch. 2014;466:1151-1162
• Cuello F, Shankar-Hari M, Mayr U, Yin X, Marshall M, Suna G, Willeit P, Langley SR, Jayawardhana T, Zeller T, Terblanche M, Shah AM, Mayr M. Redox state of pentraxin 3 as a novel biomarker for resolution of inflammation and survival in sepsis. Mol Cell Proteomics. 2014;13:2545-2557
• Candasamy AJ, Haworth RS, Cuello F, Ibrahim M, Aravamudhan S, Kruger M, Holt MR, Terracciano CM, Mayr M, Gautel M, Avkiran M. Phosphoregulation of the titin-cap protein telethonin in cardiac myocytes. J Biol Chem. 2014;289:1282-1293
• Stathopoulou K, Cuello F, Candasamy AJ, Kemp EM, Ehler E, Haworth RS, Avkiran M. Four-and-a-half LIM domains proteins are novel regulators of the protein kinase D pathway in cardiac myocytes. Biochem J. 2014;457:451-461

• Holland RJ, Paulisch R, Cao Z, Keefer LK, Saavedra JE, Donzelli S. Enzymatic generation of the NO/HNO-releasing IPA/NO anion at controlled rates in physiological media using β-galactosidase. Nitric Oxide. 2013;35:131-136
• Donzelli S, Fischer G, King BS, Niemann C, DuMond JF, Heeren J, Wieboldt H, Baldus S, Gerloff C, Eschenhagen T, Carrier L, Boger RH, Espey MG. Pharmacological characterization of 1-nitrosocyclohexyl acetate, a long-acting nitroxyl donor that shows vasorelaxant and antiaggregatory effects. J Pharmacol Exp Ther. 2013;344:339-347
• Abonnenc M, Nabeebaccus AA, Mayr U, Barallobre-Barreiro J, Dong X, Cuello F, Sur S, Drozdov I, Langley SR, Lu R, Stathopoulou K, Didangelos A, Yin X, Zimmermann WH, Shah AM, Zampetaki A, Mayr M. Extracellular matrix secretion by cardiac fibroblasts: Role of microRNA-29b and microRNA-30c. Circ Res. 2013;113:1138-1147
• 2012
• Fraysse B, Weinberger F, Bardswell SC, Cuello F, Vignier N, Geertz B, Starbatty J, Kramer E, Coirault C, Eschenhagen T, Kentish JC, Avkiran M, Carrier L. Increased myofilament Ca2+ sensitivity and diastolic dysfunction as early consequences of Mybpc3 mutation in heterozygous knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 2012;52:1299-1307
• Bardswell SC, Cuello F, Kentish JC, Avkiran M. cMyBP-C as a promiscuous substrate: phosphorylation by non-PKA kinases and its potential significance. J Muscle Res Cell Motil. 2012;33:53-60

• Sadayappan S, Gulick J, Osinska H, Barefield D, Cuello F, Avkiran M, Lasko VM, Lorenz JN, Maillet M, Martin JL, Brown JH, Bers DM, Molkentin JD, James J, Robbins J. A critical function for Ser-282 in cardiac myosin binding protein-c phosphorylation and cardiac function. Circ Res. 2011;109:141-150
• Makowski MR, Wiethoff AJ, Blume U, Cuello F, Warley A, Jansen CH, Nagel E, Razavi R, Onthank DC, Cesati RR, Marber MS, Schaeffter T, Smith A, Robinson SP, Botnar RM. Assessment of atherosclerotic plaque burden with an elastin-specific magnetic resonance contrast agent. Nat Med. 2011;17:383-388
• Haworth RS, Cuello F, Avkiran M. Regulation by phosphodiesterase isoforms of protein kinase A-mediated attenuation of myocardial protein kinase D activation. Basic Res Cardiol. 2011;106:51-63 Grube K, Rudebusch J, Xu Z, Bockenholt T, Methner C, Muller T, Cuello F, Zimmermann K, Yang X, Felix SB, Cohen MV, Downey JM, Krieg T. Evidence for an intracellular localization of the adenosine A2B receptor in rat cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 2011;106:385-396
• Cuello F, Bardswell SC, Haworth RS, Ehler E, Sadayappan S, Kentish JC, Avkiran M. Novel role for p90 ribosomal s6 kinase in the regulation of cardiac myofilament phosphorylation. J Biol Chem. 2011;286:5300-5310

• Yin X, Cuello F, Mayr U, Hao Z, Hornshaw M, Ehler E, Avkiran M, Mayr M. Proteomics analysis of the cardiac myofilament subproteome reveals dynamic alterations in phosphatase subunit distribution. Mol Cell Proteomics. 2010;9:497-509
• Mattock KL, Gough PJ, Humphries J, Burnand K, Patel L, Suckling KE, Cuello F, Watts C, Gautel M, Avkiran M, Smith A. Legumain and cathepsin-l expression in human unstable carotid plaque. Atherosclerosis. 2010;208:83-89
• Madhani M, Hall AR, Cuello F, Charles RL, Burgoyne JR, Fuller W, Hobbs AJ, Shattock MJ, Eaton P. Phospholemman Ser69 phosphorylation contributes to sildenafil-induced cardioprotection against reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;299:H827-836
• El-Armouche A, Wahab A, Wittkopper K, Schulze T, Bottcher F, Pohlmann L, King SB, DuMond JF, Gerloff C, Boger RH, Eschenhagen T, Carrier L, Donzelli S. The new HNO donor, 1-nitrosocyclohexyl acetate, increases contractile force in normal and β-adrenergically desensitized ventricular myocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2010;402:340-344
• Bardswell SC, Cuello F, Rowland AJ, Sadayappan S, Robbins J, Gautel M, Walker JW, Kentish JC, Avkiran M. Distinct sarcomeric substrates are responsible for protein kinase D-mediated regulation of cardiac myofilament Ca2+ sensitivity and cross-bridge cycling. J Biol Chem. 2010;285:5674-5682

Die Gruppe arbeitet im Wesentlichen an pharmakoepigenetischen Fragestellungen und kooperiert eng mit Marc Hirt (Kardiale Hypertrophie/micro RNAs ) und Arne Hansen ( Tissue-Engineering und Stammzellen) und ihren Arbeitsgruppen im selben Institut sowie mit der Gruppe von Tanja Zeller und Julia Krause im Bereich der kardiologischen Forschung.

Der Begriff Epigenetik ist ein Oberbegriff für all jene Chromatinmodifikationen die der mittel- bis langfristigen Transkriptionsregulation dienen. Dazu gehören beispielsweise Histonacetylierung, -methylierung, -phosphorylierung und -sumoylierung sowie DNA-Methylierung und -Hydroxymethylierung. Diese Chromatinmarkierungen können einerseits über Jahre stabil bleiben und sogar bei der Zellteilung vererbt werden. Andererseits können sie aber auch außerordentlich dynamisch sein und sind der Beeinflussung durch Arzneistoffe zugänglich.

Eine Veränderung des physiologischen Transkriptoms der betroffenen Herzmuskelzellen ist charakteristisch für hypertrophierte und pathologisch veränderte Herzmuskelzellen. Ein tieferes Verständnis der Rolle der Epigenetik für diese Regulation dieses Transkriptionsmusters könnte die Möglichkeiten für eine erfolgreiche Pharmakothrapie der Herzinsuffizienz oder auch anderer Erkrankungen wie des Vorhofflimmerns langfristig deutlich erweitern. Die Möglichkeit, die Fehlregulation der Transkription auf epigenetischer Ebene zu korrigieren hätte den besonderen Reiz, das Problem gewissermaßen an seiner Wurzel bekämpfen zu können.

Derzeit arbeiten wir hauptsächlich an DNA-Methylierung und untersuchen beispielsweise die Rolle einzelner Komponenten der zellulären Methylierungs- und Demethylierungs-Maschinerie. Dafür verwenden wir das im Institut gut etablierte Herzgewewebekulturmodell EHT (Engineered Heart Tissue), welches auf Herzmuskelzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) beruht, seit neuestem auch aus Vorhof-artigen Herzmuskelzellen. Laufende Projekte befassen sich mit der Rolle der DNA-Methyltransferase 3a (DNMT3A) für die kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz, mit der Epigenetik des Vorhofflimmerns und mit epigenetischen Veränderungen in den Bindegewebszellen des Herzens, den Fibroblasten. Darüber hinaus versuchen wir, die DNA-Methylierung in verschiedenen EHT-basierten Krankheitsmodellen als therapeutischen Angriffspunkt zu nutzen (Epigenome Editing).
Die Fibroblastenprojekte finden in einem Verbund mit Forschern in Mailand, Montpellier und Madrid statt. Zusätzlich kooperieren wir seit längerem mit der Arbeitsgruppe von Roger Foo am Genome Institute of Singapore.

Die Arbeitsgruppe wird durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG und die europäische Initiative ERA-CVD (European Research Area Network Cardiovascular Disease) gefördert.

Techniken zur funktionellen Charakterisierung von Kardiomyozyten in vitro sind limitiert. Das Ziel des EHT-Teams ist die Etablierung und Optimierung von Techniken zur Konstruktion drei-dimensionaler, Kraft-entwickelnder Herzgewebe aus Einzelzellen und die Entwicklung von Protokollen zur Analyse relevanter Parameter der Kardiomyozytenbiologie. Die Basis für dieses Vorhaben sind jahrzehntelange Erfahrungen im Bereich des kardialen Tissue Engineering sowie vor kurzem entwickelte Protokolle zur Herstellung von EHTs aus neonatalen Maus-/Rattenherzzellen und Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) unter standardisierten Bedingungen differenziert werden, und Testsysteme zur Beurteilung von Kontraktilität und Calcium-Transienten mit einem hohen Grad and Automatisierung und Reproduzierbarkeit. Spezielle Fragestellungen, die mit dieser Technologie untersucht werden, sind prädiktive Toxikologie, in vitro-Krankheitsmodellierung und therapeutische Applikation.

Prädiktive Toxikologie

Der zweithäufigste Grund für Sicherheitsprobleme in späten Phasen der Medikamentenentwicklung ist pro-arrhythmische Kardiotoxizität. Die Analyse von Kardiotoxizität während der präklinischen Medikamentenentwicklung ist zum Teil eingeschränkt durch das Fehlen menschlicher Kardiomyozyten. Wir evaluieren, ob die EHT-Technologie eine sinnvolle Ergänzung des präklinischen Testpanels zur Detektion von Kardiotoxiziät darstellen könnte. Zusätzlich sind wir an der Fragestellung interessiert, inwieweit die gleichzeitige Analyse von Kontraktilität, Potentialänderungen und Calciumtransienten (durch genetisch kodierte Sensoren) den prädiktiven Wert dieser Technologie verbessert.

In vitro-Krankheitsmodellierung

Das Verständnis von pathophysiologischen Mechanismen vieler Herzerkrankungen ist unvollständig und Programme zur Medikamentenentwicklung lückenhaft. Unser Ziel ist die Etablierung von high-content in vitro Modellen für wichtige angeborene und erworbene Herzerkrankungen. In diesem Zusammenhang optimieren wir Protokolle, um aus Fibroblasten von Patienten mit genetisch bedingten Herzerkrankungen hiPSCs zu reprogrammieren, isogene Kontrollen herzustellen (indem die Krankheits-definierende Mutation durch CRISPR/Cas9 Technologie korrigiert wird), Kardiomyozyten zu differenzieren und die Krankheitsphänotypen im EHT-Modell zu untersuchen. Außerdem haben wir im Ratten-EHT-Modell pathologische Kardiomyozytenhypertrophie durch akute Nachlasterhöhung (der häufigste Grund für Herzinsuffizienz) dargestellt in Zusammenarbeit mit der Gruppe kardiale Hypertrophie. In verschiedenen Projekten, u.a. dem ERC-geförderten Projekt IndivuHeart , transferieren diese Technologie auf EHTs aus differenzierten Kardiomyozyten. Zusätzlich werden gemeinsam mit der Arbeitsgruppe Pharmakoepigenetik epigenetische Veränderungen im Rahmen der Entwicklung von pathologischer Hypertrophie untersucht .

Therapeutische Aspekte

Myokardinfarkt führt zum Verlust von Kardiomyozyten und damit zu einer wichtigen Prädisposition für Herzinsuffizienz. Der Ansatz das verlorengegangene Herzmuskelgewebe zu ersetzen ist naheliegend, aber für die praktische Umsetzung müssen viele methodische Aspekte untersucht und optimiert werden. Unsere Strategie basiert auf einer Studie aus unserem Institut, in dem an Ratten-EHTs in einer proof of principle-Studie die Realisierbarkeit dieses Ansatzes gezeigt wurde7. Als Übertragung dieser Ergebnisse auf humane EHTs evaluieren wir die mechanistische Fragestellungen (Überleben von Kardiomyozyten nach Transplantation, elektrische Kopplung, Verbesserung der Herzfunktion) in einem Meerschweinchen-Infarkt Model.